Преподобный Нил Столобенский родился в семье крестьянина в небольшом селении Новгородской епархии. В 1505 году он принял постриг в обители преподобного Саввы Крыпецкого близ Пскова.

После 10 лет подвижнической жизни в киновии удалился на реку Серемлю, в сторону города Осташкова, где 13 лет вел строгую аскетическую жизнь в непрерывной брани с кознями диавола, которые выражались в явлениях призраков - гадов и диких зверей. Многие жители из окрестных мест стали приходить к преподобному за наставлениями, но он стал этим тяготиться и молил Бога указать ему место для подвига безмолвия. Однажды после долгой молитвы он услышал голос: "Нил! Иди на озеро Селигер. Там на острове Столобенском ты можешь спастись!" От приходивших к нему людей преподобный Нил узнал, где находится озеро, и, придя туда, был поражен его красотой. В середине озера - покрытый густым лесом остров; на нем преподобный нашел небольшую гору и выкопал пещеру, а спустя некоторое время построил хижину, в которой и прожил 26 лет. Подвиги строгого постничества и безмолвия сопровождал еще и другим, особенным подвигом - никогда не ложился спать, а позволял себе лишь легкую дремоту, опираясь на крюки, вделанные в стену келлии.

Богоугодная жизнь преподобного много раз возбуждала зависть врага, которая проявлялась через злобу местных жителей. Однажды кто-то поджег лес на острове, где стояла хижина преподобного, но пламя, дойдя до горы, чудесным образом угасло. В другой раз в хижину ворвались грабители. Преподобный сказал им: "Все мое сокровище в углу кельи". Там стояла икона Богоматери. Разбойники стали искать деньги и ослепли. Тогда в слезах раскаяния стали они молить святого о прощении. Известны и многие другие чудеса, совершенные преподобным. Он безмолвно отказывался от приношений, если совесть у приходивших к нему была нечиста или они находились в нечистоте телесной.

В предчувствии кончины преподобный Нил приготовил себе гроб. А к самому времени преставления прибыл на остров игумен одного из близлежавших монастырей и приобщил его Святых Таин. По уходе игумена преподобный Нил в последний раз совершил молитву, окадил святые иконы и келлию и предал Господу бессмертную свою душу 7 декабря 1554 года.

Прославление его святых мощей (ныне почивающих в Знаменском храме г. Осташкова) совершилось в 1667 году с установлением празднования 27 мая и в день преставления.